氣相液氮罐建立樣本庫推動個性化醫(yī)療發(fā)展

　　1樣本定義

　　特定疾病(如腫瘤、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病)患者的血液或組織相關(guān)生物標(biāo)志物的鑒定，有益于疾病的早期檢測，預(yù)防和治療。生物標(biāo)志物可用于疾病的診斷、患者預(yù)后的預(yù)測、個性化醫(yī)療的承諾。篩選樣本中存在特定基因突變的患者接受個性化治療。例如，對非小細(xì)胞肺癌進行EGFR突變檢測，來判斷患者腫瘤樣本中是否存在EGFR突變，如果存在，患者可接受個性化的治療，使用抗表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib )進行治療[1、2]，而BRAFV600突變陽性的黑色素瘤患者使用BRAF抑制劑維羅非尼(vemurafenib)治療[3]。個性化醫(yī)療為每個患者提供毒性最小的最適療法，這有賴于易得可用的高質(zhì)量、信息完整的人類生物樣本。

　　人類生物樣本包括組織、血液、尿液、骨髓及其它體液，它們是胚系DNA，RNA，蛋白質(zhì)和其他代謝物的來源，為基因組研究和生物標(biāo)志物發(fā)展所需求。存儲人類生物樣本和相關(guān)的患者臨床資料，可促進未來在治療和生物標(biāo)志物發(fā)展方面的轉(zhuǎn)化研究，這也是加強個性化醫(yī)療所必須。為了個性化醫(yī)療學(xué)奠定基礎(chǔ)，生物樣本庫應(yīng)該通過大規(guī)模的研究充分地獲得可靠的結(jié)果。比如癌癥基因組圖譜計劃(TCGA)經(jīng)過大量的努力，已經(jīng)成功對許多癌癥樣本進行分析研究，幫助編錄了不同腫瘤類型中存在的實變譜，其中包括卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺鱗狀細(xì)胞癌，透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌 。此外，通過貯存生物樣本，使得運用新技術(shù)、新方法對庫存樣本進行檢測成為可能，為未來提供更深入的了解，尤其是現(xiàn)在運用新一代測序技術(shù)，為廉價且高效對全基因組進行測序提供了一個強大的工具。

　　合理地收集、處理、貯存和追蹤生物樣本是生物樣本庫運行至關(guān)重要的部分，生物樣本庫的流程首先是獲得參與者的知情同意，然后再進行樣本采集。組織樣本可采集于接受手術(shù)或病理活檢的患者。其他的體液如尿液、血液和唾液可在臨床治療中收集。樣本收集后需進行處理、分裝并凍存于適合長期冰凍保存的容器中。患者的臨床信息須存儲于安全的數(shù)據(jù)庫中并與庫存樣本相關(guān)聯(lián)。最后，樣本和患者數(shù)據(jù)的分發(fā)必須遵循倫理規(guī)則。生物樣本庫的實際運行是高度復(fù)雜的，包括許多技術(shù)、法律、倫理和其他問題并要求通力協(xié)作[ 9 ， 10 ]。生物樣本庫的運行和管理通常需要標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)技術(shù)、質(zhì)量控制、信息技術(shù)、法律、法規(guī)、臨床和病理知識。支持個性化醫(yī)療的生物樣本庫涉及到患者護理并要求最高的操作標(biāo)準(zhǔn)、嚴(yán)格的質(zhì)量保證與質(zhì)量控制。一旦生物樣本被測序且可行性結(jié)果將被反饋到臨床實踐，這些類型的生物樣本庫應(yīng)被視為臨床生物樣本庫，且要求通過認(rèn)證，如美國病理醫(yī)生協(xié)會(CAP)認(rèn)可。[ 11 ]。

　　2.生物樣本的采集與處理

　　生物樣本應(yīng)采集于獲得知情同意的患者，知情同意提供了生物樣本庫項目和研究的詳細(xì)說明，包括闡述所有程序、參與者的作用、利益描述、合理的可預(yù)見風(fēng)險、并傳達參與的自愿性[ 12 ]。建設(shè)生物樣本庫，獲得患者知情同意是一個必須考慮的重要問題，聯(lián)邦法規(guī)如共同規(guī)則和健康保險攜帶和責(zé)任法案(HIPPA法案)要求知情同意書應(yīng)使用受試者能夠理解的通俗易懂的語言[ 13 ， 14 ]。廣泛的知情同意允許生物樣本庫貯存樣本，用于將來未明確的研究，這更大程度上是一種全面知情同意，有利于生物樣本庫的長遠(yuǎn)目標(biāo)。廣泛的同意， 通常要求機構(gòu)審查委員會(IRB)批準(zhǔn)兩個方案：一個是生物樣本庫的樣本收集方案，另一個是樣本需求和使用的研究方案。知情同意書還應(yīng)包括有關(guān)生物樣本庫參與者將來能否被再次聯(lián)系?生物樣本是否可與不屬于樣本采集機構(gòu)的外部研究人員分享?以及生物樣本是否可用于基因檢測等內(nèi)容?此外，隨著新的高通量檢測技術(shù)如下一代測序的興起，患者的知情同意應(yīng)當(dāng)闡明處理偶然發(fā)現(xiàn)的程序等。

　　生物樣本包括組織、血液、尿液、骨髓和其他體液。固體組織來源于常規(guī)臨床活檢或外科手術(shù)，需由病理醫(yī)生在其指導(dǎo)下進行采集。病理醫(yī)生在決定分配組織用于診斷或樣本庫貯存上起著必不可少的作用。具體來說，當(dāng)固體腫瘤組織離開患體時，應(yīng)由病理醫(yī)生或其助手仔細(xì)進行大體檢查，并由病理醫(yī)生決定切割組織的關(guān)鍵部份用于常規(guī)病理診斷，且在不影響常規(guī)病理診斷的情況下，組織的剩余部份才能被生物樣本庫切割收集。有時在作出最終診斷之前，分配給生物樣本庫的組織需保留在病理實驗室。

　　快速采集和高效處理對于高質(zhì)量的組織生物樣本庫是必不可少的。組織樣本從手術(shù)室轉(zhuǎn)運至病理實驗室的效率、采集前的病理學(xué)評估和處理是保持其質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。大量的研究表明長時間的體外缺血影響樣本在RNA和蛋白質(zhì)水平的質(zhì)量，并有可能影響研究結(jié)果[1 6 ， 1 7 ]。因此，一旦組織離體，病理醫(yī)生及生物樣本庫工作人員應(yīng)盡可能快地完成大體檢查和樣本處理。理想的時間是在30分鐘內(nèi)，可避免組織體外缺血時間的延長。除了組織的生物分子質(zhì)量外，后續(xù)通常需要病理醫(yī)生對庫存組織的冷凍切片進行形態(tài)學(xué)分析以評估組織學(xué)質(zhì)量。這個過程包括確認(rèn)病理診斷、組織異質(zhì)性、組織評分、腫瘤細(xì)胞的存在或缺失、炎癥和壞死面積等。庫存組織的病理學(xué)分析應(yīng)當(dāng)與患者的原始病理診斷相關(guān)聯(lián)，當(dāng)最初的病理診斷與庫存組織診斷發(fā)生差異時，庫存冷凍組織需被發(fā)放用于后續(xù)的診斷分析以確保常規(guī)診斷的正確完成。樣本庫收集新鮮冷凍組織用于貯存應(yīng)當(dāng)進行切分、速凍、并貯存于?80°C或液氮柜中，避免反復(fù)凍融保持生物樣本的完整性。生物樣本庫也可收集經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的組織塊(FFPE)進行貯存，但其相應(yīng)的H&E切片需由病理醫(yī)生進行檢測以判斷腫瘤或病變組織的面積和數(shù)量并由樣本庫收集、貯存。

　　除組織外，血液是最易獲得并在臨床和轉(zhuǎn)化研究中被廣泛使用的生物樣本類型之一，血液的采集和貯存沒有組織復(fù)雜。采集的血液應(yīng)分離成血漿、血清、血沉棕黃層和紅細(xì)胞，分別貯存使樣本的價值最大化。根據(jù)下游研究目的不同，血漿和血沉棕黃層收集于不同的抗凝管中，如乙二胺四乙酸(EDTA)鹽， 枸櫞酸鹽和肝素抗凝管。EDTA鹽抗凝管廣泛適用基于DNA和蛋白的研究 [ 18 ]，肝素抗凝的血漿通常用于代謝組學(xué)研究(18、19)。枸櫞酸鹽抗凝管對淋巴細(xì)胞有很高的得率，所以使用枸櫞酸鹽葡萄糖抗凝管收集外周血單個核細(xì)胞(18、20)。血沉棕黃層可長期貯存作為DNA和RNA來源的樣本，從而取代血液在采集時就立即分離核酸。研究表明，從血沉棕黃層提取的胚系DNA可廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)志物的研究(21、22)。血清收集于含有二氧化硅和凝血酶等促凝劑的試管中，用于臨床生化檢測和代謝組學(xué)研究[18]。英國生物樣本庫有一個全面的血液采集程序，將血液收集于不同的抗凝管和血清分離管中[ 18 ]。此外，血液中來源于癌癥的物質(zhì)如循環(huán)腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞游離循環(huán)腫瘤DNA等正成為廣受歡迎的生物樣本類型。原發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的腫瘤將循環(huán)腫瘤細(xì)胞播散于循環(huán)系統(tǒng)，與此同時DNA片斷從死亡細(xì)胞脫落進入血流[23]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞游離循環(huán)腫瘤DNA可被分離并用于跟蹤疾病的進展。因此，貯存此類基于血液的樣本為發(fā)展個性化治療提供了非常有用的資源。尿液是另一種容易獲得的生物樣本，已被廣泛用于研究蛋白、核酸或細(xì)胞?；颊呖勺孕惺占迈r尿液于潔凈容器中，如已有導(dǎo)尿管也可從從導(dǎo)尿管中收集。收集后，應(yīng)當(dāng)作全尿分裝并立即凍存。分裝的尿液也可離心將沉渣和上清分別貯存在?80 °C或液氮中。此外，唾液、腦脊液、胸水和腹水、胃灌洗、頰粘膜涂片和宮頸涂片也被認(rèn)為是有價值的樣本而被收集和貯存。此類體液樣本可全樣分裝或通過離心富集細(xì)胞，將沉積的細(xì)胞和上清液分別貯存。和組織樣本相類似，體液樣本采集后應(yīng)盡快處理并長期冷凍貯存在?80 °C或液氮中。早期檢測研究網(wǎng)絡(luò)(EDRN)對于血漿和血清采集的標(biāo)準(zhǔn)操作程序建議EDTA鹽抗凝的血漿應(yīng)立即處理或處理之前4°C保存不超過4 h，血清30–60 min形成凝塊后進行離心處理或4°C不超過幾個小時[24]。隨著新的分析技術(shù)的進步，生物樣本的類型及收集方法也將繼續(xù)發(fā)展。

　　3.生物樣本的貯存與分發(fā)

　　盡管某些類型的生物樣本如FFPE組織塊和切片可以存儲在室溫下，但是大多數(shù)生物樣本庫保存新鮮冷凍樣本，以保持核酸和蛋白質(zhì)高度完整性，因此，生物樣本通常貯存在?80°C或氣相液氮罐罐中，使其在用于實驗和分析前保持良好的狀態(tài)。固體組織樣本可以不同的方式保存。組織用液氮快速冷凍或包埋在OCT介質(zhì)中然后速凍放?80°C或氣相液氮罐罐中長期保存。FFPE組織及保存在RNAlater或PAXgene中的組織，在使用前可在室溫短期保存，但是長期保存應(yīng)該存儲在?20°C或更冷的環(huán)境下。多項研究表明， 反復(fù)凍融會導(dǎo)致組織和血液中RNA的完整性下降且血清和血漿蛋白質(zhì)組變化顯著 (25 - 28)。因此冷凍組織應(yīng)分裝后貯存以避免反復(fù)凍融。很少有關(guān)于生物樣本貯存在液氮是否比貯存在?80°C更好的信息。然而一些研究表明，樣本貯存在-70或?80°C五年，其RNA的完整性降低(29，30)。盡管血漿貯存在?70°C 59個月，蛋白質(zhì)未見降解[31]，如果可能的話，同一患者的樣本應(yīng)分裝保存于兩個不同環(huán)境中(?80 °C和氣相液氮罐罐)以保護生物樣本庫免受損失并保持生物樣本的質(zhì)量，應(yīng)首先使用貯存在?80°C冰箱中的生物樣本，氣相液氮罐罐中貯存的樣本作為“備份”，當(dāng)?80°C冰箱的樣本用完后再使用。

　　生物樣本長期低溫貯存的容器通常用螺帽凍存管。正確標(biāo)識存有樣本的凍存管對確保正確識別生物樣本是重要的。帶有條形碼的標(biāo)簽可以鏈接生物樣本和記錄在數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)并提供有效的標(biāo)識方法。貯存在?80°C和液氮中的凍存管應(yīng)用耐受冷凍保存的條形碼標(biāo)簽進行標(biāo)識，以防止開裂，剝落或老化。生物樣本的唯一編碼(ID)、樣本類型、存放于冰箱的位置以及與患者相關(guān)的個人資料和臨床信息應(yīng)集中存儲在一個安全的計算機數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中并經(jīng)常備份?，F(xiàn)有的生物樣本庫最佳實踐(如ISBER的生物樣本庫最佳實踐和NCI的生物樣本資源最佳實踐)可作為地方標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程建立的指南和參考[ 32 ， 33 ]。最近，美國病理醫(yī)生協(xié)會(CAP)開展了生物樣本管理標(biāo)準(zhǔn)化活動即CAP的生物樣本庫認(rèn)可程序。CAP的生物樣本庫認(rèn)可檢查表提高供了詳細(xì)的認(rèn)或要求發(fā)確保生物樣本庫實施標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、質(zhì)量保證、質(zhì)量控制程序。CAP認(rèn)可致力于質(zhì)量、精度及程序的一致性，這有助于顯著提高高生物樣本庫的價值和質(zhì)量并保持生物樣本庫高標(biāo)準(zhǔn)地運行。生物樣本庫對個性化醫(yī)療的支持，涉及直接患者治療，需要這樣的認(rèn)可過程來符合公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。

　　生物樣本庫的基礎(chǔ)設(shè)施和可訪問性直接影響著個性化醫(yī)療。為了能可靠地獲得高質(zhì)量且具有患者臨床資料的生物樣本，應(yīng)形成便捷可達的方法來協(xié)助查找有信息備注的樣本。信息技術(shù)對生物樣本庫數(shù)據(jù)管理和生物樣本訪問起著重要的作用。生物樣本庫信息管理系統(tǒng)的主要功能是追蹤生物樣本的收集、處理、貯存和分發(fā)，管理患者信息，并給客戶提供查詢樣本的功能?；颊叩幕拘畔?、病理診斷、樣本類型和貯存位置通常是數(shù)據(jù)庫中的基本數(shù)據(jù)元素。特定的實驗室數(shù)據(jù)，例如，乳腺癌的ER、PR和Her2/neu，非小細(xì)胞肺癌的EGFR突變情況，黑色素瘤的BRAF實變狀況及隨訪結(jié)果的數(shù)據(jù)變得越來越重要，應(yīng)該捕獲并存儲在中央生物樣本數(shù)據(jù)庫中。精準(zhǔn)的生物樣本庫存和相關(guān)的臨床資料可以明顯減少巨量的生物樣本查找和檢索任務(wù)并增強庫存生物樣本的價值。網(wǎng)絡(luò)搜索工具可協(xié)助查詢具有信息的生物樣本，將使生物樣本庫更易具訪問性(34、35)。為保護病人隱私和機密，生物樣本庫應(yīng)作為一個誠實的中間方，將所有數(shù)據(jù)存儲在受密碼保護的電腦中，電腦受機構(gòu)安全服務(wù)器的支持[ 34 ， 36 ]。受保護的健康信息在發(fā)布或披露給任何其他人或機構(gòu)時，將僅包括有限數(shù)據(jù)集的應(yīng)用，附上IRB批準(zhǔn)的數(shù)據(jù)使用協(xié)議，也可要求一份明確的患者同意。所有發(fā)布的數(shù)據(jù)應(yīng)該有一個發(fā)布編碼，如，生物樣本的參考號，以便宜樣本庫工作人員再次將數(shù)據(jù)與樣本鏈接并追蹤數(shù)據(jù)的來源。

　　生物樣本庫的運行應(yīng)接受來自多學(xué)科咨詢委員會的指導(dǎo)。委員會應(yīng)由外科、病理學(xué)、基礎(chǔ)科學(xué)、臨床科學(xué)、生物統(tǒng)計學(xué)、生物倫理學(xué)和其他相關(guān)領(lǐng)域的代表組成。咨詢委員會旨在引導(dǎo)政策、評估生物樣本需求以確保他們的科學(xué)價值并優(yōu)先分配資源，使人們公平地獲得具有價值但又有限的生物樣本。生物樣本庫花費多年的時間收集樣本、獲取隨訪的臨床信息需要充足的人員，包括病理學(xué)支持、管理和技術(shù)人員。生物樣本庫基礎(chǔ)設(shè)施的投資和運營經(jīng)費是一個重要的保證。即使是建造和運營一個小的生物樣本庫也是昂貴的(37、38)。因此，應(yīng)該得到機構(gòu)長期支持并實施收費機制使生物樣本庫長期可持續(xù)性發(fā)展。因為生物樣本庫直接涉及患者治療支持個性化醫(yī)療，可最終要求患者健康保險公司付費，這類生物樣本庫需要特定的認(rèn)可[39]。

　　4.質(zhì)量保證與質(zhì)量控制

　　個性化醫(yī)療時代的成功生物樣本庫，其最重要的方面是生物樣本的質(zhì)量。使用劣質(zhì)的生物樣本進行的研究將可能產(chǎn)生錯誤和誤導(dǎo)性的數(shù)據(jù)。質(zhì)量保證和質(zhì)量控制對生物樣本庫的運行極其重要。生物樣本庫應(yīng)有文件化的質(zhì)量管理程序和詳細(xì)的SOPs，確保生物樣本庫服務(wù)和運行的質(zhì)量。SOPs應(yīng)詳細(xì)以便工作人員容易遵循并準(zhǔn)確地執(zhí)行其中的方法，并定期對庫存生物樣本實施質(zhì)量評估程序。隨著近來新的高通量“組學(xué)”平臺技術(shù)的加速，增加對生物樣本在DNA、RNA和蛋白水平的要求，庫存新鮮冷凍組織保持核酸和蛋白質(zhì)的高度完整性變得越發(fā)重要。因此，合理地處理和鑒定生物樣本對高質(zhì)量的生物樣本庫的發(fā)展和管理至關(guān)重要。

　　使用分光光度計和變性瓊脂糖凝膠檢測人類總RNA提取質(zhì)量。分光光度計在260 和280 nm (A260：A280) 讀數(shù)的比值大于1.8表示的RNA純度可接受[40]。完整的RNA，瓊脂糖凝膠電泳有兩個明顯的條帶分別對應(yīng)于28S和18S核糖體RNA(rRNA)。RNA完整度可以通過測量28S、18S核糖體RNA的比值獲得。28S/18S大于等于2被認(rèn)為是高質(zhì)量的RNA，而通常28S：18S > 1.0，RNA可被視為質(zhì)量好[ 41 ]。由于這種方法主觀且依賴于凝膠圖像判讀。新開發(fā)的自動化RNA質(zhì)量測量設(shè)備，即RNA完整數(shù)(RIN)得到了廣泛的應(yīng)用[ 42 ， 43 ]。RIN是由軟件計算生成，是用戶對RNA質(zhì)量控制的獨立、自動和可靠的標(biāo)準(zhǔn)化程序[42]。最近，RIN e被開發(fā)并設(shè)計使用在安捷倫TapeStation平臺上，但RIN e的值相當(dāng)于RIN值[44] 。RIN或RIN e值的范圍從10到1， 通過指定完整的高質(zhì)量RNA其RIN或RIN e值為10。高質(zhì)量RNA的特點是有兩個清晰、輪廓完好的28S和18S峰，且兩峰間無干擾雜峰，在18S峰前有最小分子量干擾雜峰(圖1.)。通常RIN大于等于5被認(rèn)為是高質(zhì)量RNA，適用于RT-PCR分析[ 45 ， 46 ]。從FFPE組織或其他不同方式保存的樣本(如乙醇固定)抽提RNA通常要求嚴(yán)格的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制程序，使用安捷倫Bioanalyzer 或TapeStation得出的RIN T和RINe 值不能很好的評估分離自FFPE組織的RNA。為了準(zhǔn)確地評估FFPE的RNA質(zhì)量，在管家基因beta-actin上游和下游末端的兩組引物，用于實時PCR分析。3′末端到 5′末端PCR產(chǎn)物的較低比值表明RNA的質(zhì)量高[ 11 ]。

　　圖1. RNA質(zhì)量控制。

　　從組織和血液中提取的RNA質(zhì)量使用安捷倫TapeStation進行了分析。

　　(a) 一例高質(zhì)量RNA，顯示了高RIN e(RIN e = 9.4)，18S和28S rRNA峰清晰可見，和在18S 和28S峰之間極低的干擾雜峰。

　　(b) 下一組顯示部分降解RNA，低RIN e(RIN e = 5.9) (RIN e = 5.9)，兩峰之間和18S峰前高干擾雜峰。

　　(c) a和b的RNA，凝膠圖像相同

　　從庫存樣本抽提的DNA通常用分光光度法測量，如用Nanodrop判斷DNA的量和純度。RNA的測量也一樣，分光光度法測量260 和 280 nm (A260：A280)的讀數(shù)的比值大于1.8表明DNA的純度是可接受的。為了評估DNA的質(zhì)量，看管家基因的幾套引物如：β-globin可用來擴增不同長度的片斷，最大擴增片斷的大小與DNA質(zhì)量成正相關(guān)。 最近，開發(fā)的安捷倫TapeStation提供一步法評估DNA的數(shù)量和質(zhì)量 [47]。用TapeStation檢測，高質(zhì)量的DNA呈清晰的單條帶，而降解的DNA呈彌散狀大小不等的片段條帶(圖2. )。從血沉棕黃層及其他非組織生物樣本(血液、血液分離物、尿液等)提取的DNA和RNA 的完整度可用同樣的方法檢測，以評估非組織樣本的質(zhì)量。

　　圖2. DNA質(zhì)量控制。從組織和血液中提取的DNA質(zhì)量使用安捷倫TapeStation進行分析

　　(a)一個高質(zhì)量DNA例子，用安捷倫TapeStation顯示一個大片段的DNA外觀。

　　(b)低質(zhì)量的DNA，用安捷倫TapeStation顯示生成DNA片段彌散。、

　　(c)a和b的DNA，凝膠圖像相同

　　蛋白質(zhì)定量的幾種不同分析方法有二辛可寧酸法、Lowry蛋白分析法、Bradford法來測定蛋白質(zhì)濃度以及SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后考馬斯藍(lán)染色以確定蛋白質(zhì)組的完整性。特定的抗原包括磷酸化的蛋白質(zhì)可以用免疫印跡和免疫組織化學(xué)染色鑒定。由于這些蛋白質(zhì)質(zhì)量評價方法通常并非經(jīng)濟有效。最好留給終端研究者， 根據(jù)其具體的應(yīng)用和分析流程去實施他們自己的蛋白質(zhì)質(zhì)量評估。同樣地，血漿、血清及其他的體液的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制主要依賴于研究者的反饋。選擇的參數(shù)(如采樣與凍存之間有時間間隔、貯存溫度、貯存期限有及可接受的凍融循環(huán)次數(shù))形成文件對于體液的質(zhì)量保證是重要的。其他的實驗室活動如文件控制、記錄控制、內(nèi)部審核和糾正、預(yù)防措施對生物樣本庫的質(zhì)量管理程序也很重要。

　　5.病理醫(yī)生在生物樣本庫中的作用

　　病理醫(yī)生在生物樣本庫中的作用已得到很好的認(rèn)可(48 - 50)。因為病理醫(yī)生的作用在于在檢查人體組織以便診疾病的診斷或治療。只有病理醫(yī)生了解組織的哪一部份需要用于診斷，哪一部份能夠用于生物樣本庫保存。由于大多數(shù)固體癌組織標(biāo)本是由由不同成分的細(xì)胞類型組成的(如腫瘤、癌旁正常，基質(zhì)、炎癥細(xì)胞等);提交給生物標(biāo)本庫的固體腫瘤組織應(yīng)當(dāng)由病理醫(yī)生檢查以確定樣本的組織學(xué)特征。最近的一項研究表明，由外科醫(yī)生或病理醫(yī)生助理明確指定的腫瘤和癌旁正常組織要求病理醫(yī)生進行研究顯微鏡檢查，因為提供的腫瘤樣本是正常和腫瘤組織的混合物，而正常組織實際上是腫瘤[43]。因此，組織樣本的組織學(xué)質(zhì)量控制必須由一個病理醫(yī)生執(zhí)行，對庫存生物樣本的組織切片進行形態(tài)學(xué)檢查(圖3.a )。固體組織最低限度的質(zhì)量控制至少應(yīng)當(dāng)制作組織切片鏡檢[ 51 ]。對于某些浸潤性方式生長類型的腫瘤如胰腺癌、前列腺癌組織， 質(zhì)量控制要求連續(xù)低溫恒溫切片。OCT包埋的冷凍組織塊的最前部份應(yīng)當(dāng)切片、H&E染色用于組織學(xué)檢查，留取部分用于核酸的抽提。其最后的部份切片、H&E染色以證實腫瘤的存在。

　　組織學(xué)質(zhì)量控制報告應(yīng)該包括病理診斷證據(jù)、疾病狀態(tài)、腫瘤純度的評估、正常、基質(zhì)、壞死細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞等百分比的記錄。重要的是確保生物樣本庫貯存的組織生物樣本(腫瘤或正常)準(zhǔn)確地記錄在數(shù)據(jù)庫中。此外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)靈敏度的增加，不同的結(jié)果可能代表占主導(dǎo)地位細(xì)胞類型而不是感興趣的細(xì)胞類型(如。腫瘤細(xì)胞)。大部分實體腫瘤組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是由形態(tài)和功能上獨特的細(xì)胞類型(如腫瘤、正常、基質(zhì)細(xì)胞)異質(zhì)混合組成的。為了減少組織內(nèi)異質(zhì)性，在RNA/DNA/蛋白抽提用于下游分析前，通常需用手工大切割或激光捕獲顯微切割來選擇感興趣的特定細(xì)胞(如，腫瘤細(xì)胞)，以增強特定細(xì)胞的純度[52 ]。無論是大切割還是激光捕獲顯微切割都要求病理醫(yī)生的專業(yè)技術(shù)去識別特殊細(xì)胞類型(腫瘤和正常細(xì)胞)，并使得腫瘤和/或正常細(xì)胞由生物樣本庫技術(shù)員進行大切割或微切割(圖3. b，c)

　　圖3.組織的組織學(xué)質(zhì)量控制和優(yōu)化。

　　(a) 一例卵巢腫瘤組織OCT塊的H&E片，經(jīng)病理確診，腫瘤、正常、壞死等的百分比經(jīng)病理醫(yī)生評估。

　　(b) 核酸提取之前，大切割腫瘤富集部位。

　　(c)一例子卵巢腫瘤組織，腫瘤小于10%，核酸提取之前，使用激光捕獲微切割腫瘤。

　　組織微陣列(TMA)能夠同時快速地對大批組織樣本進行形態(tài)學(xué)評估。與免疫組化，原位雜交和熒光原位雜交(FISH)分析相結(jié)合，TMA為高通量篩選靶向分子、促進從發(fā)現(xiàn)分子到臨床應(yīng)用的快速轉(zhuǎn)化提供了一個強大的工具[53、54]。庫存的樣本是構(gòu)建TMA的巨大資源，因此TMA技術(shù)結(jié)合可用的庫存生物標(biāo)本可以大大有助于腫瘤分析、生物標(biāo)志物鑒定和驗證。TMA塊是通過將腫瘤組織從許多石蠟塊或OCT塊轉(zhuǎn)移到單個的TMA接受塊制備而成。病理醫(yī)生應(yīng)當(dāng)對來源于原始蠟塊或OCT包埋塊的H&E片進行檢驗，確定合適的腫瘤灶并將其轉(zhuǎn)移到TMA接收塊中。TMA切片用H&E或其他特殊染色后，由病理醫(yī)生對多個病人的腫瘤樣本同時進行原位分析(圖4.) 。在個性化醫(yī)療時代，對用于TMA分析和高通量技術(shù)如基因組和蛋白質(zhì)組的分析的腫瘤組織有很高的要求，需具有高質(zhì)量、完整的臨床信息。在生物樣本庫的運行和管理中，病理醫(yī)生提供了獨特的專業(yè)技術(shù)，因此他們是重要的貢獻者。

　　圖4.生物樣本庫的組織芯片

　　(a) 一例前列腺TMA塊，包含多個病人腫瘤組織。從TMA塊切片、H&E染色，病理醫(yī)生作形態(tài)分析后，進行免疫組織化學(xué)和原位雜交試驗，，對大量的腫瘤組織樣本進行物高通量的生物標(biāo)志物分析。

　　(b) TMA有代表性的芯

　　6.全基因組和外顯子測序

　　新的下一代高通量測序正迅速成為分子遺傳學(xué)分析的標(biāo)準(zhǔn)。人類全基因組的和全外顯子組測序有望終將徹底改變醫(yī)療實踐。下一代測序能迅速而廉價對每個腫瘤的全基因組和全外顯子測序，正改變著腫瘤學(xué)的實踐，并為個性化醫(yī)療開辟了新的途徑。人們一直嘗試著基于每個患者樣本特征，通過高通量技術(shù)進行個性化治療[ 55 ， 56 ]。下一代測序的進展可以檢測多個基因和通路的突變，反過來，用合理的費用生成一個全面的個體突變圖譜，這極大地促進了人們對靶向治療的選擇。下一代DNA和RNA測序無疑需要信息完整、，高質(zhì)量的人類生物樣本[57]。使用庫存樣本進行下一代測序所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，應(yīng)當(dāng)存放在一個安全的中央數(shù)據(jù)庫中，以便未來研究使用。測序數(shù)據(jù)連同患者的臨床信息為新的發(fā)現(xiàn)提供了寶貴的數(shù)據(jù)資源，而無需重復(fù)采集生物樣本，從而減少了后續(xù)研究的費用。這些數(shù)據(jù)的重復(fù)使用極大地保證了轉(zhuǎn)化與臨床研究的效率和效果。然而，如未來分析這些數(shù)據(jù)超出最初的研究范圍，應(yīng)當(dāng)納入到知情同意文件并需要一個單獨的IRB批準(zhǔn)。為了保護患者隱私和機密，患者的信息識別需要通過計算機生成的條形碼來查找，測序數(shù)據(jù)和患者臨床信息之間唯一的鏈接應(yīng)該保存在一個安全的數(shù)據(jù)庫中。全基因組和全外顯子測序以及生物樣本庫在鑒定基因變異以及基因變異與藥物療效、臨床結(jié)果之間的關(guān)系中發(fā)揮著越來越重要的作用，并為推進個性化醫(yī)療奠定了基石、鋪平了道路。

　　7.管理偶然發(fā)現(xiàn)

　　下一代測序能夠產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，這些通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出最初研究所要求測序的數(shù)據(jù)。偶然(或附帶)的結(jié)果越來越多且不可避免。它們具有潛在的臨床意義，但與最初研究無關(guān)。盡管關(guān)于歸還基因組研究偶然發(fā)現(xiàn)有很大爭議，但人們建議，由CLIA(臨床實驗室改進修正案)認(rèn)可的實驗室確認(rèn)的某些發(fā)現(xiàn)和結(jié)果，揭示了既定的或?qū)嵸|(zhì)性的嚴(yán)重健康風(fēng)險，并具備臨床可操作性，這些發(fā)現(xiàn)和結(jié)果應(yīng)當(dāng)歸還給同意參與的生物樣本庫參加者(58 ，59)。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)推薦了最低條件，返回在臨床測序中偶然發(fā)現(xiàn)的基因和變異，其中包括為遺傳性乳腺癌和卵巢癌BRCA1和BRCA2， 家族性腺瘤息肉病的APC和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB1等[60]。最近，生命倫理研究總統(tǒng)委員會，白宮顧問小組建議研究人員、臨床醫(yī)師以及直接面向顧客的公司在產(chǎn)生基因組、影像或其他類型的生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)時應(yīng)有計劃應(yīng)對偶然發(fā)現(xiàn)，并就如何處理這些發(fā)現(xiàn)制定與患者、研究參與者和顧客溝通的計劃[ 61 ]。盡管將結(jié)果返回參與者的過程會給生物樣本庫帶來明顯的費用，但生物樣本庫應(yīng)當(dāng)支持個性化醫(yī)療，努力建立返還偶然發(fā)現(xiàn)的責(zé)任機制。隨著個性化醫(yī)療的持續(xù)成長和發(fā)展，必須實施特殊的程序或政策來決定如何處理這些發(fā)現(xiàn)。

　　8.結(jié)論

　　個性化醫(yī)療為改善患者狀況提供了真正的希望。靶向治療開始使個性化醫(yī)療在腫瘤學(xué)上成為現(xiàn)實。針對特殊患者群體的高效藥物靶向治療的例子，如Her2過度表達/擴增的乳腺癌患者使用赫賽汀(Herceptin) [ 62 ， 63 ]，攜帶BRAF V600E突變的黑色素瘤患者使用維羅非尼(Vemurafenib)[ 62 ， 64 ]，攜帶ALK突變的非小細(xì)胞肺癌患者使用克唑替尼(Xalkori)[ 65 ]。這些生物標(biāo)志物增強了腫瘤學(xué)家決定使用毒性最小化的最佳治療方案的能力。生物樣本庫在新的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)方面發(fā)揮著重要的作用，為新的個性化療法的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。生物樣本庫的發(fā)展和運行非常復(fù)雜，需要廣泛的機構(gòu)合作、重大的制度支持。高質(zhì)量的生物樣本庫發(fā)展和運行需要標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)技術(shù)、質(zhì)量控制、信息技術(shù)、法律和倫理來管理生物樣本庫實踐，還需要具備與利益相關(guān)方溝通和洽談的技巧。涉及患者治療的生物樣本庫通過采集和貯存生物樣本或衍生物用于臨床相關(guān)分子檢測是一個令人鼓舞的的活動，但需要最高標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量保證、質(zhì)量控制和必要的認(rèn)證和認(rèn)可。大量收集帶有患者臨床信息的生物樣本，在個性化治療中有效地挖掘生物標(biāo)志物是至關(guān)重要的。同時病理醫(yī)生應(yīng)當(dāng)參與到生物樣本庫的運行和管理中去。庫存組織的收集、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制必須由訓(xùn)練有素的病理醫(yī)生或其指導(dǎo)下完成，以確保下游分子和基因組檢測結(jié)果的可靠性和可重現(xiàn)性。創(chuàng)新性高通量下一代測序技術(shù)正迅速成為分子基因檢測的標(biāo)準(zhǔn)，生物樣本庫在支持個性化醫(yī)療的過程中，應(yīng)當(dāng)努力建立處理偶然發(fā)現(xiàn)的責(zé)任機制。最終，隨著個性化醫(yī)療的擴展，在醫(yī)療中心內(nèi)為患者提高供標(biāo)準(zhǔn)化的治療，生物樣本庫將是必須的