氣相液氮罐的應(yīng)用與疾病生物樣本庫(kù)建設(shè)與管理

大數(shù)據(jù)時(shí)代加上現(xiàn)金最炙手可熱的細(xì)胞治療。研究者更關(guān)注樣本的生物信息數(shù)據(jù)與疾病臨床信息的相關(guān)性，通過(guò)大樣本的關(guān)聯(lián)分析，來(lái)預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。疾病生物樣品庫(kù)便是關(guān)聯(lián)疾病臨床信息與樣本生物信息的橋梁與核心，是生命科學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究的關(guān)鍵源頭，是進(jìn)行大樣本驗(yàn)證、快速實(shí)現(xiàn)生物醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的核心環(huán)節(jié)。近幾年，我國(guó)疾病生物樣本庫(kù)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)得到政府與科學(xué)家們的高度關(guān)注、醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)與專(zhuān)家們的高度重視、企業(yè)與技術(shù)部門(mén)大力支持，廣大科研、醫(yī)務(wù)工作者的積極響應(yīng)，呈現(xiàn)良好發(fā)展勢(shì)頭。從樣本資源來(lái)說(shuō)，中國(guó)最大的特點(diǎn)是樣本資源量大，資源種類(lèi)多樣化。在中國(guó)一個(gè)月的就診數(shù)量，在國(guó)外達(dá)到同樣的病例數(shù)可能要幾個(gè)月，如胸腺腫瘤類(lèi)，據(jù)說(shuō)整個(gè)歐洲的例數(shù)甚至少于中國(guó)的一家三甲專(zhuān)科醫(yī)院。目前，我國(guó)生物樣本庫(kù)有專(zhuān)家?guī)臁⒖剖規(guī)?、多學(xué)科庫(kù)、重大項(xiàng)目庫(kù)、醫(yī)院庫(kù)、區(qū)域庫(kù)等，不少醫(yī)院（尤其三甲醫(yī)院）紛紛著手建立自己的樣本庫(kù)，其中有精品庫(kù)、價(jià)值庫(kù)、特色庫(kù)，也有不少垃圾庫(kù)、死庫(kù)。

疾病生物樣本庫(kù)建設(shè)

建設(shè)樣本庫(kù)的基本原則建樣本庫(kù)是安全、準(zhǔn)確、便捷。其中安全包括樣本生物安全、樣本信息安全、設(shè)備運(yùn)行安全；準(zhǔn)確包括樣本信息準(zhǔn)確、樣本存放取出位置準(zhǔn)確；便捷包括工作流程便捷、軟件系統(tǒng)操作便捷、信息交流便捷、硬件軟件耗材供應(yīng)及技術(shù)支持便捷。樣本庫(kù)通常由基礎(chǔ)設(shè)施、凍存設(shè)備——主要由氣相液氮罐構(gòu)成、凍存耗材、編碼及讀碼設(shè)備、監(jiān)控設(shè)備、管理軟件和人員配置構(gòu)成。合理的架構(gòu)及流程可以保證樣本庫(kù)運(yùn)行安全、準(zhǔn)確、便捷。

基礎(chǔ)設(shè)施

基礎(chǔ)設(shè)施一般包括質(zhì)檢室、樣本處理室、冰箱室、氣相液氮罐設(shè)備室、監(jiān)控室、空調(diào)設(shè)備、備份電源等。其中需要注意的是：冰箱是產(chǎn)熱設(shè)備，需要和液氮設(shè)備分開(kāi)放置。立式冰箱如不能背靠墻擺放，可保持一定距離背對(duì)背擺放?？紤]到超低溫冰箱目前仍是組織庫(kù)的主要存儲(chǔ)設(shè)備，在運(yùn)行過(guò)程中會(huì)大量產(chǎn)熱，配備樣本庫(kù)空調(diào)時(shí)對(duì)其功率和性能可靠性需要給予足夠的考慮。備份電源也是樣本庫(kù)的基本配備。在供電不夠十分穩(wěn)定的地區(qū)，在選擇冰箱時(shí)還要考慮到冰箱的溫度絕緣性（即滿(mǎn)載樣品時(shí)斷電后溫度上升的速度）。當(dāng)樣本容量足夠大時(shí)，還需要考慮使用自動(dòng)化取放樣品的設(shè)備。對(duì)于特別重要的樣本，條件許可的情況下可以將樣本的備份分開(kāi)放置于不同的物理地點(diǎn)以增加安全性。

基本設(shè)備

⑴-80度凍存設(shè)備（超低溫冰箱）：超低溫冰箱穩(wěn)定工作的溫度通常在-800C左右，在取放樣品的時(shí)候很容易升至-600C的再結(jié)晶溫度范圍，容易造成樣本生物穩(wěn)定性的衰減。所以在選用超低溫冰箱的時(shí)候制冷能力（速度）是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。制冷能力強(qiáng)的冰箱能夠在溫度受到擾動(dòng)的，快速降至設(shè)定的溫度以盡量減少對(duì)樣本的傷害。另外，由于樣本庫(kù)的目的是長(zhǎng)期存放樣品，超低溫冰箱需要在滿(mǎn)載情況下多年不間斷運(yùn)行，對(duì)其可靠性和溫度穩(wěn)定性都比普通實(shí)驗(yàn)室的要求要高。樣本庫(kù)的冰箱需要有運(yùn)行溫度的連續(xù)記錄功能，以便追蹤溫度波動(dòng)。

⑵-140度凍存設(shè)備（氣相液氮罐和深冷冰箱）：氣相液氮罐和深冷冰箱是實(shí)現(xiàn)-1400C長(zhǎng)期樣品儲(chǔ)存的常用設(shè)備。這兩種方法因?yàn)椴淮嬖谝旱M(jìn)入樣本內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)，因而儲(chǔ)藏期間沒(méi)有樣本間交叉感染的危險(xiǎn)。深冷冰箱是相對(duì)較新的一種設(shè)備，從近幾年的客戶(hù)使用反饋來(lái)看，在滿(mǎn)載樣品的情況下能夠?qū)崿F(xiàn)-140~-1500C的穩(wěn)定環(huán)境，得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。氣相液氮罐是更受廣泛認(rèn)可的方法，美國(guó)國(guó)家癌癥協(xié)會(huì)等機(jī)構(gòu)的樣本庫(kù)操作規(guī)范文件中均推薦使用氣相液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存組織樣本。氣相液氮罐是在液氮容器中加入一定量液氮，樣本儲(chǔ)存在容器中不與液氮直接接觸的空間。液氮容器內(nèi)氣相區(qū)間的溫度最低（容器口處）不高于-1400C。較少的樣本量可以使用液氮罐儲(chǔ)存，盡量使用適配凍存盒的液氮罐消耗的液氮量較大一些，但由于其取放樣品的便捷以及樣品不易落入液氮罐的特點(diǎn)，越來(lái)越多的液氮罐用戶(hù)采用了這類(lèi)配置。大量的樣本對(duì)取放的便捷性及液氮加注自動(dòng)化要求更高，目前主要使用液氮儲(chǔ)存箱。通常需要液氮自動(dòng)檢測(cè)設(shè)備和自動(dòng)加注設(shè)備，包括液氮供應(yīng)罐、液氮塔和液氮管道等。

⑶-196度凍存設(shè)備（液氮罐和液氮儲(chǔ)存箱）：液氮罐能使樣本維持在-1960C的低溫，是目前技術(shù)條件下所能達(dá)到的最佳樣本庫(kù)保存溫度。與氣相液氮罐相比液氮液相更易實(shí)施，液氮罐內(nèi)可裝滿(mǎn)液氮，儲(chǔ)存更多的樣本，但對(duì)盛裝樣本的凍存管等耗材的要求更高。凍存造血干細(xì)胞的血袋可以直接在液氮內(nèi)儲(chǔ)存，但凍存管不能直接放入液氮內(nèi)儲(chǔ)存，需要經(jīng)過(guò)處理，要求嚴(yán)格的可使用凍存管套對(duì)凍存管全身密封，這一方法需要更高的凍存盒和更大間隔的凍存架。簡(jiǎn)易方法是可使用密封膜對(duì)凍存管管帽和管身接合處密封，一些常用10x10底部間隔的凍存盒即可兼容，不需要特殊的凍存管架。從目前客戶(hù)的反應(yīng)以及文獻(xiàn)來(lái)看，這一方法雖然簡(jiǎn)易，但效果還比較可靠。

監(jiān)控設(shè)備

監(jiān)控設(shè)備包括冰箱溫度探頭、冰箱運(yùn)行溫度記錄，液氮罐液位監(jiān)控、遠(yuǎn)程報(bào)警、視頻監(jiān)控等。超低溫冰箱和深冷冰箱都需要實(shí)時(shí)監(jiān)控溫度。盡管很多廠家在設(shè)備上有溫度測(cè)量和數(shù)據(jù)輸出裝置，不少用戶(hù)選擇另行安裝溫度探頭單獨(dú)監(jiān)控溫度。溫度探頭的位置建議放于冰箱溫度最高的底部區(qū)域以確保樣品安全。冰箱的運(yùn)行溫度記錄也是基本的要求。遠(yuǎn)程報(bào)警系統(tǒng)目前常用手機(jī)報(bào)警結(jié)合網(wǎng)絡(luò)報(bào)警。溫度探測(cè)裝置會(huì)將超過(guò)正常溫度范圍的警報(bào)通過(guò)在冰箱等設(shè)備中預(yù)制的手機(jī)SIM卡自動(dòng)給相關(guān)管理人員手機(jī)短信實(shí)時(shí)報(bào)警，同時(shí)相關(guān)信息也會(huì)通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)或數(shù)據(jù)線向管理軟件系統(tǒng)報(bào)警。近年來(lái)視頻監(jiān)控逐漸成為很多實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)配置，除了在走廊、出口等處安置常規(guī)攝像頭監(jiān)控外，在樣品處理、冷凍等關(guān)鍵操作環(huán)節(jié)安置可調(diào)焦距的高分辨率攝像頭可以遠(yuǎn)程實(shí)時(shí)監(jiān)控并記錄操作人員的操作細(xì)節(jié)是否規(guī)范，對(duì)加強(qiáng)人員管理保證樣品質(zhì)量很有幫助。

其它設(shè)備

樣本庫(kù)通常還需要進(jìn)行一定的樣品運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移。-20度樣本轉(zhuǎn)移一般用冷凝膠包（Gel pack），-700C用干冰，-1500C以下用液氮運(yùn)輸罐。為避免包裹遞送因意外原因延誤，樣本包裝里需要配備至少24小時(shí)的制冷劑余量。凍存管架直接影響容器樣本存儲(chǔ)能力，需要根凍存設(shè)備、耗材的類(lèi)型具體選用或定制。樣本量特別大的庫(kù)還可能用到自動(dòng)化存取設(shè)備，這一方案目前只和-800C設(shè)備配套使用，需要使用特定的管理軟件凍存設(shè)備。

所有來(lái)源于人的樣本都被認(rèn)為是具有潛在感染性和有害的，必須經(jīng)過(guò)相關(guān)病原體檢驗(yàn)和相應(yīng)處理才能入庫(kù)。樣品處理必須在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。生物安全柜能實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本潔凈性以及操作者和環(huán)境的同時(shí)保護(hù)，但超凈臺(tái)的風(fēng)是由里到外吹的，只能保護(hù)樣本的潔凈性，不能保護(hù)操作者和環(huán)境免受潛在病原體的危害。

凍存耗材

與普通實(shí)驗(yàn)室相比，樣本庫(kù)的樣品保存時(shí)間更長(zhǎng)，對(duì)樣本中各種成份穩(wěn)定性和完整性的保護(hù)要求更嚴(yán)格，使用數(shù)量更大，因此對(duì)耗材的性能特點(diǎn)及規(guī)格挑選有更高的要求。

目前樣本庫(kù)常用的樣本存儲(chǔ)耗材是1~5 ml的凍存管，其中2 ml的凍存管是最常用，有些廠家把實(shí)際容量2 ml和5 ml的凍存管分別標(biāo)稱(chēng)為1.8 ml和4.5 ml的工作容量以提醒使用者不要裝滿(mǎn)，防止液體冷凍是體積增加破壞密封性。除了常規(guī)單個(gè)使用的凍存管，還有一些按96孔板大小整版存放的凍存管，使用專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的形狀和管蓋，以便使用自動(dòng)化機(jī)械手臂操作。

由于聚丙烯（Polypropylene, PP）能夠耐受低溫（-1960C），具有相對(duì)較低的液氮滲透性和較好的化學(xué)試劑耐受性（如DMSO），因此聚丙烯被最為普遍的用于制作凍存管。凍存管作為生物樣本儲(chǔ)存過(guò)程中直接與樣品接觸的物質(zhì)，其原材料的可靠性級(jí)別也直接影響了所裝載物質(zhì)的安全性。聚丙烯材料的級(jí)別可基本從四個(gè)方面去判斷：純凈性、無(wú)菌性、化學(xué)耐受性和對(duì)生物分子（細(xì)胞、蛋白、RNA和DNA等）的吸附性。

美國(guó)藥典（USP）將塑料等級(jí)分為6級(jí)，其中6級(jí)塑料需進(jìn)行多項(xiàng)與細(xì)胞接觸性反應(yīng)測(cè)試，以確保其對(duì)細(xì)胞的毒性最低，可用于醫(yī)療器械產(chǎn)品的制備。因此在樣本儲(chǔ)存中建議盡量選用的塑料凍存管為超純醫(yī)用級(jí)原始樹(shù)脂，并能通過(guò)USP Class VI的測(cè)試。長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中凍存管材對(duì)生物大分子的吸附性是十分重要的考慮因素。對(duì)血樣，尤其是提純的微量生物大分子樣本來(lái)說(shuō)，普通的塑料管材容易在長(zhǎng)期儲(chǔ)存中因吸附而造成樣本內(nèi)某些生物大分子濃度降低，破壞樣本的完整性。因此樣本庫(kù)中建議使用專(zhuān)用的性能可靠的凍存管，不建議使用微量離心管等非專(zhuān)用耗材。另外為了更好地長(zhǎng)期保持密封性，美國(guó)國(guó)家腫瘤協(xié)會(huì)組織庫(kù)建議使用帶有螺紋密封的凍存管，不建議使用插拔式或者彈出蓋子式的耗材。凍存管的螺旋有內(nèi)旋和外旋之分，外旋是為超低溫冰箱設(shè)計(jì)的，內(nèi)旋是為更低的溫度比如液氮?dú)庀嗷蛏罾浔湓O(shè)計(jì)的。但液氮內(nèi)直接存放凍存管需要對(duì)凍存管進(jìn)行進(jìn)一步的防護(hù)，以免液氮泄露。液氮泄露進(jìn)凍存管不僅容易造成凍存管在化凍時(shí)爆炸破壞樣品并危及操作者，更嚴(yán)重的后果是造成樣本間交叉感染。凍存管的無(wú)菌程度也是一個(gè)重要指標(biāo)，尤其是對(duì)于將來(lái)可能用于臨床使用的樣本，盡可能滿(mǎn)足或者接近2010年新版中國(guó)藥典對(duì)耗材的要求（SAL 10-6）。

對(duì)于一些體積較大的樣本，目前市面上Nalgene有一款15ml的廣口無(wú)菌凍存管可用于5-15ml的液體或者較大的組織器官儲(chǔ)存。更大的液體體積可以使用血袋。廣口無(wú)菌凍存管和血袋能夠耐受-1960C低溫。

樣本管理信息化

普通實(shí)驗(yàn)室手寫(xiě)標(biāo)記的凍存管已經(jīng)很難滿(mǎn)足樣本庫(kù)的大容量?jī)龃嫘枨?。一種常見(jiàn)的解決方案是現(xiàn)場(chǎng)編輯并打印一維或者二維編碼及樣本信息，然后手工粘貼到普通凍存管上。另一種解決方案是選擇廠家激光蝕刻了二維編碼的凍存管。從編碼的識(shí)別性和牢固度等多種角度比較兩種方案，后一種方案在實(shí)際應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見(jiàn)的，也是目前發(fā)展的方向。預(yù)設(shè)二維碼的耗材成本整體來(lái)看高于現(xiàn)場(chǎng)打印編碼方案，但打印編碼的方案對(duì)標(biāo)簽紙張、打印質(zhì)量、粘合劑都有特殊的要求，需要耐受長(zhǎng)期低溫儲(chǔ)存及一定的濕度，普通打印紙和普通油墨容易發(fā)生標(biāo)簽脫落、字跡模糊和油墨成本如鉛等污染樣本。這些額外的成本甚至能和普通凍存管價(jià)格相當(dāng)，需要在做預(yù)算的時(shí)候加以充分考慮。紙質(zhì)的凍存盒是普通實(shí)驗(yàn)室早期使用的凍存盒，近年來(lái)已經(jīng)被聚碳酸酯的凍存盒替代，尤其是在-1400C以下的溫度。樣本庫(kù)對(duì)穩(wěn)定性可靠性的要求比一般實(shí)驗(yàn)室更高，建議使用聚碳酸酯的凍存盒，有些聚碳酸酯的凍存盒在需要的情況下還可以高溫高壓滅菌。有些標(biāo)準(zhǔn)尺寸的聚碳酸酯凍存盒使用底部柱形間隔可以放置10x10個(gè)2 ml或2 ml 以下外旋或者內(nèi)旋凍存管。同樣外部尺寸的紙質(zhì)凍存盒的間隔設(shè)計(jì)通常只能放置9X9個(gè)2 ml外旋或內(nèi)旋凍存管。

在樣本庫(kù)潛在樣本容量較大的情況下，需要使用二維編碼，這時(shí)預(yù)制二維編碼就體現(xiàn)出了難以替代的優(yōu)點(diǎn)。首先紙質(zhì)標(biāo)簽上打印的二維編碼經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期冷凍之后識(shí)別率比較低，因此目前使用的一維和二維混合打印編碼的標(biāo)簽實(shí)際上主要還是依賴(lài)一位編碼提供可靠識(shí)別。其次預(yù)制二維編碼管能夠?qū)崿F(xiàn)快速讀碼，更能滿(mǎn)足樣本庫(kù)高通量需求。預(yù)制二維碼的凍存管采用96孔板的儲(chǔ)存格式（SBS footprint），可使用自動(dòng)化讀碼儀一次性從底部讀取整板上所有的凍存管，從而盡量減少取樣時(shí)間，降低讀碼取樣過(guò)程中樣品升溫造成的傷害。

由于不同的樣本庫(kù)在編碼讀碼設(shè)備、監(jiān)控設(shè)備、冷凍設(shè)備、耗材、樣本容量等方面有較大的差異，管理軟件通常是根據(jù)用戶(hù)的具體配置和要求量身定做的，有些情況下還需要與實(shí)驗(yàn)室其他管理軟件整合，并在后期的使用中根據(jù)需求和反饋進(jìn)一步改進(jìn)。由于管理軟件、設(shè)備及耗材編碼設(shè)備為一個(gè)整體系統(tǒng)，所以在選擇軟件時(shí)應(yīng)考慮系統(tǒng)兼容性。軟件對(duì)監(jiān)控設(shè)備、報(bào)警設(shè)備的整合、界面友好程度、可擴(kuò)展性和穩(wěn)定性也都是重要考慮因素。另外管理軟件中對(duì)樣本信息需要設(shè)置管理權(quán)限以保證樣本來(lái)源的隱私。管理軟件有設(shè)備/耗材廠家配套提供的，第三方軟件公司提供的，也有樣本庫(kù)根據(jù)自己的需求自行制作。

疾病生物樣本數(shù)據(jù)庫(kù)作為大數(shù)據(jù)時(shí)代重要的資源，對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸以及治療的研究意義重大。實(shí)現(xiàn)樣本庫(kù)的質(zhì)量管理、信息數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)化與標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)共享將是大數(shù)據(jù)時(shí)代樣本庫(kù)建設(shè)的三項(xiàng)關(guān)鍵任務(wù)。其中，疾病生物樣本及其信息的質(zhì)量管理將決定并影響研究的結(jié)果。因此，實(shí)現(xiàn)疾病生物樣本的質(zhì)量管理制度以及相關(guān)質(zhì)量檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)樣本庫(kù)質(zhì)量的持續(xù)改進(jìn)，將有助于疾病研究的發(fā)展。